Les méthodes d’étude de la cellule

  1. Les techniques microscopiques
    1. La microscopie photonique
      1. Généralités
        1. Définition : examen d’objets agrandis en présence de photons (UV & visible)
        2. Domaines d’application : jusqu’à 0.2 µm
      2. Le microscope à fond clair
        1. Description
          1. Partie mécanique
            • Statif
            • Tube binoculaire
            • Tube porte objectif
          2. Partie optique
            • Source lumineuse
            • Système condenseur – diaphragme
            • Objectifs 4x/10x/40x/100x
            • Oculaires 10x/…
        2. Principe de formation de l’image
          1. Objectif à image agrandie inversée réelle
          2. Oculaire à image intermédiaire agrandie inversée virtuelle
        3. Caractéristiques essentielles du microscope
          1. Ouverture numérique : ON = n . sin a
          2. Limite de séparation :
          3. Pouvoir de résolution : 1/d
          4. Grossissement : G = g1 . g2
        4. Applications
          1. Histologie
          2. Hématologie
          3. Parasitologie
          4. Bactériologie
      3. Le microscope à fond noir
        1. Principe
          1. Eclairage par un condenseur à fond noir
          2. Aucune lumière ne pénètre dans l’objectif
          3. Observations des contours de la cellule par diffraction
        2. Applications
          1. Bactériologie
      4. Le microscope à contraste de phase
        1. Principe
          1. Objectif avec anneau de phase intégré
          2. Modification de la phase des rayons lumineux à variation d’intensité lumineuse
        2. Applications
          1. Observation de cellules vivantes
      5. Le microscope à fluorescence
        1. Principe de la fluorescence
          1. C’est l’émission de lumière suite à l’absorption de photons
          2. E = h . n = h . c/l ó l2 > l1
          3. Différents types de fluorescence
            • Primaire : produite naturellement par certaines substances biologiques (ex : chlorophylle)
            • Secondaire : obtenue artificiellement en liant un composé non fluorescent avec un composé fluorescent (fluorochromes)
        2. Les microscopes à fluorescence
          1. A lumière transmise
          2. A lumière réfléchie (épifluorescence)
        3. Applications
          1. Bactériologie (cytométrie sur filtre)
          2. Immunofluorescence
      6. Le microscope confocal
        1. Principe
          1. Ce microscope permet de collecter l’image réfléchie au niveau d’un plan focal et d’éliminer les images du dessus (dessous) de ce plan par balayage laser
        2. Applications
          1. Neurobiologie
      7. Préparation des échantillons en microscopie optique

    1. La microsopie électronique
      1. Le microscope électronique à transmission
        1. Principe
          1. On diminue la limite de séparation en diminuant la longueur d’onde d’excitation à utilisation des électrons à la place des photons
        2. Caractéristiques
          1. d = 1 nm
          2. G = de 1400x à 500 000x
        3. Description
          1. Canon à électrodes
          2. Accélérateur d’électrons
          3. Lentille électromagnétique
          4. Ecran fluorescent de visualisation
      2. Le microscope électronique à balayage
        1. Principe
          1. Les cellules sont traitées par des sels de métaux lourds
          2. Les électrons émis par la cathode vont balayer la surface de la cellule
        2. Caractéristiques
          1. d = 10 nm
          2. G = 20 000x
        3. Applications
          1. Biologie cellulaire
      3. Préparation des échantillons
        1. Coloration positive
          1. Fixation chimique
          2. Déshydratation
          3. Inclusion dans la résine
          4. Coupes de 50 à 100 nm
          5. Dépôt de sels de métaux lourds à augmentation du contraste
        2. Coloration négative
          1. Les sels de métaux lourds se déposent après évaporation de l’eau autour des particules
        3. Ombrage de particules & réplication de surface
          1. Réalisation de répliques quand la surface est trop épaisse pour être traversée par les électrons
        4. Cryodécapage & cryofracture
          1. Cryofracture
            • Congélation des organites dans l’azote liquide
            • Fracture du bloc
            • Réplication par ombrage
          2. Cryodécapage
            • Congélation ultra rapide
            • Fracture de l’échantillon
            • Sublmation de l’eau sous vide
            • Réplication
  2. Les techniques de fractionnement des constituants cellulaires
    1. Préparation de l’homogénat cellulaire
      1. Méthodes permettant la rupture de la membrane plasmique
        1. Mécanique : broyage
        2. Choc osmotique
        3. Congélations décongélations successives
        4. Ultra-sons
        5. Attaque enzymatique
      2. Précautions à respecter pour obtenir un bon homogénat
        1. Liquide isotonique
        2. Basse température
        3. En présence d’agents réducteurs
        4. PH neutre
    2. La séparation des organites
      1. Par centrifugation différentielle
        1. Augmentation de la vitesse et du temps
      2. Par centrifugation en gradient de densité (ultracentrifugation)
        1. Principe : séparation des organites en fonction de leur constante de sédimentation, fonction de leur masse molaire
          1. Séparation en solution de saccharose de 5 à 20 %
          2. Dépôt des organites en surface
          3. Centrifugation : arrêt de la migration quand les organites rencontrent une couche de saccharose de densité supérieure à la leur
          4. Séparation des organites en fractions ( = aliquotes)
    3. Suivi de la séparation des fractions
      1. Utilisation de marqueurs moléculaires des organites
        1. Ce sont des enzymes caractéristiques de ces organites
        2. On peut aussi évaluer la purification par microscopie
    4. Applications
      1. Utilisation de systèmes cellulaires
        1. Ex : synthèses protéiques in vitro
  3. Techniques de marquage cellulaire
    1. Techniques cytochimiques et immunocytochimiques ; techniques cytoenzymologiques
      1. Techniques cytochimiques
        1. Mise en évidence d’un composé chimique de la cellule au microscope optique/électronique
      2. Techniques immunocytochimiques
        1. En microscopie optique
        2. En microscopie électronique
      3. Techniques cytoenzymologiques
        1. Mise en évidence dans une cellule de protéines à activité enzymatique
    2. Techniques de marquage isotopique
      1. Principaux isotopes utilisés en biologie
        1. X(A, Z) : A différent, Z identique
        2. Isotopes non radioactifs : 15N
        3. Isotopes radioactifs : a, b, g
        4. 3H ; 14C ; 131I ; 32P ; 35S
        5. Dosage de la radioactivité dans un compteur à scintillation
      2. Détection qualitative de la radioactivité ; localisation de molécules radioactives dans la cellule par autoradiographie
        1. " pulse chase "
          1. On place une coupe de tissus dans un milieu nutritif contenant de la Leu radioactive
          2. L’acide aminé est incorporé dans la protéine
          3. Coupes de tissus dans un milieu contenant de la Leu froide.
          4. On peut donc observer le déplacement de la Leu dans la cellule
        2. Localisation : autoradiographie
          1. On recouvre la coupe cellulaire d’une émulsion photo
          2. Les rayons ionisants ont dégagés
          3. Apparition de grains d’argent précipités

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