Méthodes d’Etude
des Peptides et
des Protéines

I.    Masse moléculaire minimum

Isolation et purification de l’échantillon
Hydrolyse par HCl à 6 mol/L 24 h
Etude : x% de A dans la protéine à M_protéine = 1/100/x * M_A

II.   Relargage des sels minéraux

La solubilité varie en fonction de la teneur en sels minéraux
Mise en jeu de la force ionique du milieu
Gel utilisé : sulfate d’ammonium
Séparation par ultracentrifugation

III.   Dialyse

Séparation des molécules en fonction de leur masse moléculaire
Utilisation d’une membrane semi-perméable
    Retient certaines protéines (masse précise)
    Laisse passer l’eau et les plus petites molécules

On peut donc trier par tamissage les protéines

IV.    Ultra-filtration

Même principe que la dyalyse
Filtration sous pression à possibilité de concentrer les protéines

V.   Chromatographies

    1.    Principe
Séparation des constituants en leur faisant traverser un mélange qui les ralentit plus ou moins fortement


    2.    Chromatographie échangeuse d’ions
Séparation en fonction du pH_i des protéines
Dans une colonne neutre, on fait passer des protéines chargées négativement
Emergence des protéines dans l’ordre des pH_i croissants


    3.    Gel-filtration
Séparation des molécules en fonction de leur taille
Fins granules sphériques dans la colonne, parois percées de pores réguliers
Les molécules trop grosses sont exclues du gel et restent dans le solvant
Solvant d’élution pour les faire émerger à volume mort ou d’initiation v₀
Molécules plus petites retardées
Emergence des protéines dans l’ordre des masses moléculaires décroissantes
1^er pic : v₀ ; autres : valeurs particulières de la masse
Log M = k.V_e


    4.    Chromatographie d’affinité
Basé sur l’aptitude d’une protéine à se lier spécifiquement à un ligand
Utilisation de granules inertes auquel on fixe par liaison covalente le ligand dans une colonne
Seule la protéine spécifique va se lier, les autres sont entraînées par le solvant (tampon)
Décrochage par une solution de ligand : compétition
Décrochage possible par un réactif capable de casser la liaison protéine-ligand

VI.    Electrophorèse

    1.    Principe
A pH donné, une protéine est porteuse d’une charge électrique ; on applique donc un courant électrique


    2.    En solution
Electrophorèse en veine liquide
Séparation entre un compartiment contenant la protéine et un compartiment ne contenant que le solvant
Les protéines se déplacent plus ou moins rapidement en fonction du pH_i
Lecture par procédé optique (spectro, …)


    3.    Sur un support
Feuille de papier, plaque de gel
Les extrémités plongent dans des bacs contenant des solutions tampon entre 7 et 9
On relie les bacs par une source de courant continu
Révélation des protéines par un colorant (amidoshwartz, bleu de bromophénol, …)
Lecture de l’intensité et de la migration des taches


    4.    Electrophorèses associées à d’autres procédés

Electrophorèse et tamissage moléculaire
Gel de polyacrylamide (variation de concentration de 4 à 30 %) : les fibres du gel constituent des mailles
Dépôt de l’échantillon du côté le moins concentré
Electrophorèse
Plus les protéines sont éloignées du départ, plus leur masse moléculaire est petite
Nécessite un étalonnage


Electrofocalisation
Utilisation de gels d’ampholine (variation de pH)
Chaque protéine se charge en fonction du pH_i
Pôle positif relié au pH le plus faible
Si pH_i > pH, migration vers pôle négatif, stop à pH_i


Electrophorèse en milieu dissociant
Séparation des sous unités d’un polymère par le SDS
Chaque monomère se lie à un certain nombre de molécules de SDS par des liaisons hydrophobes de la chaîne latérale et le SDS
Utilisation d’un gel de polyacrylamide homogène tamponné (1 % de SDS)
Etude du rapport caractéristique
Moins le gel résiste, plus la particule migre, plus elle est petite
Avec un étalonnage, on peut donc séparer les protéines et déterminer leur masse molaire


Immunoélectrophorèse
Couplage à la réaction antigène-anticorps
Dans un gel tamponné, antigène ; autre gel, anticorps ; après un certain temps à précipitation
Formation d’autant d’arcs de précipitation que de systèmes antigène-anticorps

VII.    Ultracentrifugation

    1.    Principe
Séparation par la force centrifuge (10⁵ g)
F_c = m.w²x
m : masse ; w : vitesse angulaire du rotor ; x : distance de la protéine à l’axe de rotation


    2.    Ultracentrifugation de zone en gradient de densité
Utilisation d’une solution de saccharose de concentration croissante vers le fond
Echantillon à la surface
Séparation des molécules en fonction de leur densité quand les protéines atteignent le gradient correspondant à leur densité


    3.    Mesure de la viytesse de sédimentation
Densité du solvant constante, déplacement des protéines suivie par optique
Constante de sédimentation :
x : distance de la protéine à l’axe de rotation ; w : vitesse angulaire = 2pn (n : nombre de tours / s) ; t : temps en s
S dépend de la température, de la nature du solvant, …


S est aussi proportionnelle à la masse de la molécule

R : constante des gaz parfaits (8,31.10⁷ ergs.mol^-1.°^-1)
q : température absolue (273 + 20 K)
v : volume partiel spécifique de la solution
r : densité du solvant
D_20,w : coefficient de diffusion de la substance à 20 °C dans l’eau

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