Les Acides Nucléiques

 

  1. Composition

    1. Généralités

    1. Les constituants
Acide Phosphorique H3PO4 Dosage à pureté des acides nucléiques
Pentoses b-D-RiboFurannose (ARN) b-D-2-DésoxyRiboFurannose (ADN)
Bases Bases Puriques Bases pyrimidiques
Adénine Guanine Cytosine Uracyle Thymine
Propriétés Il existe des formes tautomères (doubles liaisons conjuguées)

Les bases sont très stables

Tous les constituants sont dans un même plan

Absorbtion en UV à l = 260 nm
  1. Association des trois éléments
    1. Liaison ose – base
    2. Liaison H3PO4 – ose
    3. Liaison H3PO4 – ose – base
      1. Dénomination des nucléotides
      2. Ex : AMP, TMP, ATP, …
  2. Association de nucléosides dans un acide nucléique
    1. Liaisons
    2. Schématisation
    3. Convention d’écriture
      1. Extrémité 5’-Phosphate = extrémité contenant le groupement phosphate avec deux –OH libres
      2. Extrémité 3’-OH = extrémité contenant un seul –OH libre
      3. On oriente la chaîne dans le sens 5’-P _ 3’-OH
  1. Acides Désoxyribonucléiques (ADN)
    1. Structure d’un ADN
      1. Structure primaire
      2. Structure secondaire
        1. Chargaff
          1. Rapport d’asymétrie = coefficient de Chargaff :
          2. La composition en bases de l’ADN est très variable d’une espèce à une autre, par contre c’est une constante dans l’espèce
        2. Watson et Crick
          1. L’ADN est une double hélice par appariement de bases ( et A = T ) par pont hydrogène
          2. Double brun : phénomène de réplication
          3. Enroulement autour d’un axe commun de deux chaînes complémentaires orientées dans des directions opposées : antiparallèles
          4. 10 nucléotides par tour = 3,4 nm ; pas = 2 nm
      3. Taille et organisation
        1. Chromosome à chromatine à nucléosomes à 200 paires d’ADN + 8 histones
        2. Bactéries : 4000 kb, circulaire, 2,5.109 Da
        3. Homme : 2 900 000 kb, linéaire
    2. Propriétés des ADN
      1. Solubilité
        1. Solubles dans l’eau : groupements phosphate à sels
        2. Insoluble dans l’éthanol
      2. Absorption dans l’UV : 260 nm
      3. Densité
        1. dARN > dADN > dProtéine
        2. Cf. Ultracentrifugation en gradient de densité
      4. Dénaturation thermique : fusion
        1. On observe une modification brutale des propriétés physiques de la molécule à partir d’une température critique, notée TM (Melting Temperature), 50% de l’ADN est alors sous forme monobrun
        2. L’effet hyperchrome est du à la perte de la structure double hélice : rupture des ponts hydrogène ; la structure primaire est inchangée
    3. Rôle des ADN
      1. Support de l’information génétique
  2. Les Acides Ribonucléiques (ARN)
    1. Structure des ARN
      1. Liaisons 3’-5’
      2. Bases G et A ; C et U
    2. Répartition et état des ARN
      1. Généralités
        1. Localisation : cytoplasme
        2. Types :
          1. Ribosomique : 82 %
          2. Transfert : 16 %
          3. Messager : 2 %
      2. L’ARN ribosomique


      Dans les ribosomes nécessaires à la synthèse protéique

      1. L’ARN messager
        1. Intermédiaire entre le noyau et le cytoplasme
        2. La séquence de l’ARNm est complémentaire de celle d’un brun d’ADN
        3. La synthèse de l’ARNm nécessite des enzymes dont l’ARN polymérase
          1. Eucaryotes : ARNm = monoistronique (1ARNm ó 1 protéine)
          2. Procaryotes : ARNm = polyistronique
      2. Les ARN de transfert
        1. Véhicule les acides aminés jusqu’aux ribosomes (synthèse protéique)
        2. ARN 4S : 73 à 93 nucléotides
    3. Propriétés des ARN
      1. Absorption dans l’UV : 260 nm
      2. Extraction et séparation
        1. Elimination des protéines par action du phénol et SDS
        2. Purification par précipitation dans l’éthanol
        3. Séparation par
          1. Ultracentrifugation à gradient de densité
          2. Chromatographies
          3. Gel filtration
  3. Analyse et séquençage des acides nucléiques
    1. Analyse
      1. Dosage des acides nucléiques
        1. Hydrolyse acide puis dosage de H3PO4
        2. Dosage des oses
          1. Ribose par le réactif de Bial
          2. Désoxyribose par la DiPhénylAmine
      2. Séparation par électrophorèse
        1. Utilisation de tamis moléculaires car tous les acides nucléiques ont le même rapport (Taille / Charge) donc même mobilité
        2. Révélation des spots par
          1. Bromure d’éthidium (fluorescence orange en UV)
          2. Autoradiographie
          3. Bleu de méthylène
    2. Séquençage d’un ADN
      1. Définition
        1. Détermination de l’ordre dans lequel les nucléotides sont liés les uns aux autres
        2. Méthode des coupures chimiques (Maxam & Glibert)
          1. Fragments d’ADN monobrun et ARN
          2. Marquage au 32P sur le 5’-P
          3. Réactif qui détruit sélectivement un nucléotide (coupure des liaisons phosphodiester)
          4. Réaction
          5. Exemple
            • Séquence *TCCGATCGAACC
            • Coupures : en G, en C, en G-A, en C-T
            • Tableau obtenu & résultats de l’électrophorèse
        3. Méthode par réplication enzymatique (Sanger)
          1. Copier un segment d’ADN monobrun par de l’ADN polymérase I avec un mélange de dXTP et ddXTP (didéoxy et déoxy) ; de *dXTP et *ddXTP
          2. Marquage au 32P sur le 5’-P
          3. ddXTP provoque l’arrêt de l’élongation de l’ADN
          4. On obtient le brun complémentaire de l’ADN
          5. Réaction
          6. Exemple
            • Séquence :5’-GCTTAGCCACCGA-3’
            • Tableau & résultat d’électrophorèse
  4. Les principaux types d’hydrolyse chimique des acides nucléiques
Hydrolyse chimique Hydrolyse enzymatique (nucléases, coupures au niveau des ponts phosphodiester)
Par acide à chaud : hydrolyse totale

ADN ou ARN nH3PO4 + base + ose

 Endonucléases : agissent à l’intérieur de la molécule pour libérer des oligonucléosides

Exemples :
* RNAse T1 (G du côté 5’)
* RNAse Pancréatique (C/U du côté 5’)

Enzymes de restriction : détruisent ADN étranger pénétrant dans la bactérie, coupure au niveau du site de restriction
Ex : EcoR1
Par base diluée

ARN ribonucléosides 5’-P

 Exonucléases : attaquent l’extrêmité de la chaîne en libérant un à un les nucléotides sans spécificité

Exemples :
* Phosphodiestérase de rate de bœuf (ARN à partir de 5’-OH, libère des 3’-P)
* Phosphodiestérase de venin de serpent (ARN à partir de 3’-OH, libère des 5’-P)
  1. Techniques utilisées en génie génétique
    1. Définitions
      1. Génie génétique
        1. Ensemble des techniques qui permettent d’isoler des gènes et de les étudier puis de les modifier et les transférer de leur organisme d’origine à un autre organisme
        2. L’insertion de gènes se fait par des vecteurs : plasmides, bactériophages, levures
      2. Clonage
        1. Il est possible d’isoler un gène et de l’amplifier à volonté, on forme un clone
        2. C’est l’ensemble des descendants résultants de la multiplication d’une seule cellule initiale
        3. Toutes les cellules d’un même clone possèdent le même ADN
    2. Choix du segment d’ADN à cloner
      1. Les outils utilisés
        1. Enzymes de restriction pour couper l’ADN
        2. Sondes moléculaires marquées pour suivre l’ADN
        3. Structures de transfert
      2. La technique de Southern = blotting
        1. Digestion de l’ADN par enzyme de restriction
        2. Electrophorèse sur gel d’agarose
        3. Blotting sur film de nitrate de cellulose
        4. Hybridation moléculaire
        5. Autoradiographie
      3. La technique Polymerase Chain Reaction (PCR)
        1. ADN + dXTP + Taq Polymérase (allonge la séquence) + tampon
        2. Dénaturation (1 min à 95°C)
        3. Hybridation des amorces (1 min à 55°C)
        4. Elongation (2 min à 72°C) (21copies)
        5. On peut aller jusqu’à 2n copies (retour à l’étape b)
    3. Transformation d’une cellule et obtention d’un clone
      1. Préparation de l’ADN du plasmide et de l’ADN du chromosome à modifier
      2. Réunion des segments par de l’ADN-ligase à molécule d’ADN recombinante
      3. Introduction dans la cellule hôte (cellule transfectée)
      4. Clonage de la cellule
    4. Applications
      1. Constitutions de banques d’ADN
      2. Dépistage de maladies héréditaires
      3. Production de protéine recombinante en pharmacie

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